Enzimologia

Prof. André Ferraz

Essa página está sendo preparada em caráter experimental. Ela é um roteiro de estudos para parte da disciplina "Enzimologia". Estamos fazendo uso da INTERNET para facilitar ao aluno a busca de informações sobre a disciplina, bem como para direcionar o estudo aos tópicos de interesse e para deixar questões abertas à discussão em sala de aula. No segundo semestre de 2002, vários alunos que cursaram a disciplina, opinaram favoravelmente ao uso da internet para antecipar informações que serão apresentadas e discutidas em sala de aula. No entanto, tenha claro que a consulta a esse roteiro não substitui a necessidade de busca de informações na bibliografia recomendada.

Como ocorre com todas as páginas da WEB, estaremos constantemente atualizando as informações disponíveis. Por isso, mande críticas, sugestões e correções para aferraz@debiq.eel.usp.br.

Bom proveito e estude com dedicação,

André Ferraz

Página atualizada em 19/01/2010

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Aspectos formais da disciplina

Verifique aqui o cronograma de execução da disciplina em 2010

Conteúdo da disciplina e sistema interativo de informações

1. A origem das enzimas (funções bioquímicas e organelas celulares)

meio extracelular

membrana celular

meio intracelular

Representação de uma célula

- A célula, para sobreviver, capta substâncias no meio extracelular, as transporta para seu interior (através da membrana semipermeável) e as transforma em moléculas úteis ao metabolismo.

- Grande parte das transformações realizadas pela célula é catalisada por enzimas. Há situações em que transformações extracelulares também são catalisadas por enzimas (enzimas produzidas dentro da célula e secretadas no meio extracelular). Estas transformações extracelulares usualmente são necessárias quando a substância alvo é muito grande (massa molar elevada) para permear a membrana celular.

- Pode-se então dividir as enzimas em intracelulares e extracelulares.

Essa disciplina abordará como essas enzimas atuam, como podem ser obtidas e purificadas e quais suas aplicações tecnológicas. A parte teórica compreenderá, além de uma breve revisão sobre a estrutura e as propriedades das enzimas, a apresentação de conceitos e métodos experimentais que darão suporte à execução das aulas práticas previstas para o curso.

1.1. O mercado mundial de enzimas

Bibliografia recomendada:

Industrial Enzimology, Godfrey T. e West S (eds), 1996, Cap 1

- Antes de iniciar o estudo das enzimas, vale ao Engenheiro ter em mente a magnitude do mercado mundial de enzimas e suas perspectivas de crescimento.

- Usualmente a produção de enzimas é avaliada pelo montante de vendas e não pela quantidade produzida. Primeiro porque há grande disparidade de preços entre as enzimas, onde enzimas de uso massivo custam pouco e se contrapõem às enzimas de uso analítico ou farmacêutico que são produzidas em menor escala, porém comercializadas a preços mais elevados. Segundo porque, como veremos mais adiante nesse curso, as enzimas são quantificadas pela atividade enzimática de seus preparados e não em kg ou qualquer outra unidade de massa.

- Outro aspecto relevante é a distribuição de mercado dessas enzimas de acordo com suas aplicações. Trata-se de um mercado que inicialmente dependia basicamente da demanda dos setores alimentícios e de detergentes. No entanto, a tendência atual é o surgimento de novos setores usuários e em processos cada vez mais específicos.

- Em sua maioria, as enzimas produzidas industrialmente são de natureza hidrolítica (cerca de 75% em 1994).

- Entre as enzimas hidrolíticas de maior mercado, estão as proteases (usadas como coagulantes na indústria de laticínios e na indústria de detergentes) e as lipases (usadas na indústria de detergentes). Um segundo grupo de enzimas hidrolíticas compreende as carbohidrases usadas na despolimerização de polissacarídeos nas indústrias de panificação, de cerveja, de amido e de produtos têxteis.

- O mercado de enzimas atual está se diversificando. As enzimas destinadas a produção de “especialidades” passaram a apresentar destaque representando cerca de 50% do mercado, com ênfase para enzimas usadas na indústria da biotrasformação (fármacos, principalmente) e nos kits de diagnóstico (enzimas com fins analíticos).

- A implantação de programas de produção de etanol combustível a partir de amido de milho na América do Norte dará ainda mais importância ao uso de amilases que se destinam a hidrólise do amido até glicose.

- No mesmo sentido, a implantação iminente do programa de geração de etanol combustível a partir de materiais lignocelulósicos na América do Norte e Europa, além do Brasil deve alterar a distribuição atual dos setores de enzimas no mercado, pois o uso de celulases para a hidrólise enzimática de biomassa passará a ter grande relevância dentro do mercado mundial.

- Ainda antes de discutirmos em detalhes a obtenção, a ação e as aplicações de enzimas de interesse tecnológico, vale lembrar que os produtos comerciais a base de enzimas são efetivamente formulações complexas que têm as enzimas como agente ativo. Porém, essas formulações agregam vários aditivos com finalidades de diluição, estabilização e preservação das enzimas.

Páginas web de interesse sobre mercado de enzimas e empresas produtoras:

www.novozymes.com (NOVOZYMES - Maior empresa produtora de enzimas no mundo)

www.genencor.com (Genencor - Segunda maior empresa produtora de enzimas no mundo)

www.amano-enzyme.co.jp/english (Amano - Lider Japonesa na produção de enzimas)

www.novozymes.com.br (NOVOZYMES no Brasil – Auraucária, PR)

www.iogen.ca (IOGEN – empresa Canadense com atuação na prod de celulases para o processo Etanol de biomassa)

Faça também uma busca na internet sobre "world enzyme market" e veja o que há de novo nesse tema

Veja ainda:

Schmid A., Dordick J.S., Hauer B., Kiener A., Wubbolts M. and Witholt B. (2001) Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature 409, 258-268 (Artigo de revisão sobre desenvolvimentos relativamente recentes envolvendo a aplicação biocatalítica de enzimas e células inteiras e suas implicações para a indústria química)

2. Estrutura e propriedades das enzimas

Bibliografia recomendada:

Biotecnologia Industrial, Almeida Lima et al., vol 3; 2001, Cap. 14, itens 14.1 e 14.2 e/ou;

Biotecnologia, Scriban R., 1985, Parte 3, Cap 1, itens 1.1 e 1.2 e/ou;

Bioquímica, Lehninger et al. 1976, vol 1, Cap 5,6, 8 e 9

- Enzimas são catalisadores, e portanto, atuam no sentido de diminuir a energia de ativação de determinada reação.

Pode-se representar a reação como segue:

E + S D ES D EP D E + P , onde:

E = enzima; S = substrato; P = produto

- O que diferencia as enzimas dos catalisadores inorgânicos, é que as enzimas são proteínas e têm sua atividade determinada pelas características estruturais da proteína.

Aqui se faz necessário recapitular alguns conceitos básicos da química de proteínas

(abordados nas disciplinas anteriores de bioquímica)

Bibliografia recomendada:

Bioquímica, Lehninger et al., 1976, vol 1, Cap 5 e 6 e/ou;

Biotecnologia Industrial, Almeida Lima et al. 2001, vol 3; Cap. 14, itens 14.1 e 14.2.

Biotecnologia, Scriban R., 1985, Parte 3, Cap 2 e/ou;

Biochemistry, Voet D e Voet JG, 1995, Cap 3.

Estrutura primária: é determinada pela seqüência de aminoácidos que ocorrem na molécula protéica.

Estrutura secundária: As ligações C-N nas amidas (que compõem o polipeptídeo) possuem um certo caráter de dupla ligação C-N. Isso restringe o movimento giratório das ligações peptídicas e usualmente dá origem a estruturas não lineares. Uma configuração característica que ocorre nos polipeptídeos é a alfa-hélice que é observada na queratina. Nessa proteína há pontes de hidrogênio entre o H ligado ao N da ligação peptídica e o O carbonílico do terceiro aminoácido adjacente.

Estrutura terciária: As estruturas terciárias são observadas nas proteínas globulares e dependem, basicamente de torções ao longo da cadeia peptídica que levam a formar estruturas enoveladas.

- A estrutura terciária é muito importante para as proteínas com capacidade catalítica (enzimas), pois muitas vezes o sítio ativo da enzima ocorre no interior desse "novelo" e comumente permite um "acesso" restrito, habilitado somente para alguns tipos de moléculas.

Estrutura quaternária: resulta da interação de várias cadeias polipeptídicas devido a interações físicas (como ponte de hidrogênio) ou mesmo ligações covalentes, como as pontes de dissulfeto intercadeia.

- A ação catalítica da quimotripsina (uma enzima proteolítica, ou uma protease) é um exemplo ilustrativo de como a reação depende da estrutura tridimensional da enzima. Note que é necessário que os aminoácidos de número 57 (His) e 195 (Ser) estejam espacialmente próximos para que a enzima possa realizar a hidrólise de uma ligação peptídica.

Pense: Como seria a correspondente hidrólise de uma ligação peptídica catalisada por ácidos e não por enzimas. Consulte um livro de química orgânica se necessário. Faça um contraponto entre os dois tipos de reação.

- O conhecimento da estrutura das enzimas é crítico, pois dessa estrutura depende a atividade catalítica. Como é possível imaginar, essa estrutura, mantida basicamente por interações do tipo ponte de hidrogênio e forças de Van der Waals, pode facilmente ser perdida dependendo do meio ao qual a enzima está sujeita.

- Em geral pode-se observar que embora as enzimas sejam catalisadores muito eficientes, elas são menos resistentes a condições severas de reação quando comparadas com os catalisadores inorgânicos. Ou seja, qualquer agente externo que possa interferir no arranjo estrutural, pode desnaturar a enzima e torná-la inativa. Entre esses agentes externos cabe ressaltar o efeito marcante do: pH; da temperatura e; da força iônica e natureza do solvente.

Pense: O equilíbrio químico ácido-base correspondente às funções nitrogenadas, ácidos carboxílicos e álcoois é fundamental para entender as faixas ideais de funcionamento de um sítio catalítico de uma enzima.

Como o pH pode afetar a ação catalítica?

Equilíbrio ácido-base em grupos Nitrogenados:

exemplo com íon amônio NH₄⁺ + H₂O D NH₃ + H₃O⁺

Equilíbrio ácido-base em grupos carboxílicos:

-COOH + H₂O D -COO^- + H₃O⁺

Equilíbrio ácido-base em grupos álcoois

R-OH + H₃O⁺ D R-OH₂⁺ + H₂O

Obviamente, todos esses equilíbrios dependem do pH. Ou seja, o equilíbrio será deslocado para um dos lados dependendo do pH da solução. O que define a população de cada espécie em água é a constante de equilíbrio, ou os respectivos pKas ou pKbs.

Considerando que o pKa do grupo nitrogenado da histidina 57 na quimotripsina é igual a 6,0, o que você esperaria para a atividade catalítica estudada anteriormente em pH 4,0 e pH 7,0?

Pense: Exemplo complementar: Lisozima

2.1 – Especificidade das enzimas para o substrato

- As enzimas podem apresentar especificidade diferenciada frente aos seus substratos.

- Há enzimas extremamente específicas, que podem, por exemplo, diferenciar isômeros de um mesmo substrato. Por exemplo, a aspartase catalisa a reação (reversível) de adição de amônia ao fumarato, produzindo o L-aspartato. A especificidade nesse caso é tão grande que o isômero cis do fumarato (o maleato) não pode sofrer a adição de amônia, nem o D-aspartato pode ser desaminado pela enzima.

- A especificidade de uma enzima pelo substrato pode existir, pois deve haver uma complementaridade entre as estruturas do substrato e a do sítio ativo da enzima, ou seja, o substrato deve acoplar-se de uma única forma ao sítio ativo e então dar início à reação catalítica. Algumas enzimas podem reconhecer isômeros óticos de um mesmo substrato ou até mesmo centros pró-quirais de um determinado substrato.

- Por outro lado, há enzimas menos específicas que podem atuar sobre uma diversidade maior de substratos. Em geral, essas enzimas apresentam o sítio catalítico (ou sítio ativo) relativamente desimpedido. Entre essas enzimas destacam-se as oxido-redutases.

3. Purificação de enzimas

3.1. Fontes de enzimas de interesse tecnológico

Bibliografia recomendada:

Biotecnologia Industrial, Almeida Lima et al. 2001, vol 3; Cap. 14-16 e/ou;

Industrial Enzimology, Godfrey T. e West S (eds), 1996, Cap 1 e/ou;

Biotecnologia, Scriban R., 1985, Parte 3, Cap 2.

Enzimas de origem microbiana

- A grande maioria das enzimas utilizadas industrialmente é produzida a partir de microrganismos, através de processos fermentativos. As enzimas de origem microbiana representam cerca de 90% do mercado, excluindo-se aqui as enzimas contidas nos cereais malteados (origem vegetal) que, por serem usadas in situ, não são primariamente consideradas como enzimas industriais.

- O processo de produção industrial de enzimas de origem microbiana, pode ser dividido em duas etapas:

1) Processo fermentativo (tema de outras disciplinas desse curso)

2) Processo de separação e recuperação das enzimas a partir da fermentação

veja nesse link, como as empresas informam seus processos: Novozymes

- O processo de separação e recuperação depende inicialmente do tipo de enzima de interesse, intracelular ou extracelular. No caso das enzimas extracelulares, o processo de recuperação tem início no líquido fermentado ou no caso de fermentações em meio sólido, no líquido de extração do substrato. No caso das enzimas intracelulares é necessário aplicar algum método prévio de ruptura celular a fim de liberar as enzimas.

- Em todas as etapas de separação e recuperação das enzimas é necessário manter condições não desnaturantes, isto é, condições nas quais as enzimas não perderão atividade.

- Em geral o material fermentado (ou o extrato de fermentações em meio sólido) segue as seguintes etapas de tratamento:

1) Separação sólido-líquido para remoção das células do microrganismo envolvido

2) Refrigeração até cerca de 5ºC (manutenção de temperatura adequada para preservar a atividade das enzimas)

3) Concentração da solução, quer por evaporação a vácuo ou ultrafiltração através de membranas que permitem a passagem de solução de compostos de baixa massa molar e conseqüente retenção da(s) enzima(s) de interesse.

4) Etapas de purificação adicionais nos casos onde o produto comercial é fornecido com elevado grau de pureza.

5) Secagem em condições não desnaturantes nos casos de produtos comercializados como pó.

No caso das enzimas de interesse serem intracelulares, há demanda por operações unitárias adicionais:

1) Após a separação sólido-líquido mencionada anteriormente, as células são recuperadas

2) Uso de algum processo de ruptura celular. Industrialmente os processos mais aplicados são a moagem em moinhos de bolas de vidro e a ruptura sob alta pressão (de fato, extrusão de uma suspensão de células). Ultra-som, digestão alcalina e digestão enzimática, também são aplicáveis, mas industrialmente não têm obtido êxito.

3) Nova separação sólido-líquido a fim de eliminar os fragmentos de célula insolúveis

4) O sobrenadante pode ser processado como o caldo fermentado, porém é comum a demanda por algumas etapas de purificação adicional a fim de eliminar outros constituintes intracelulares presentes. Principalmente a aplicação de alguma técnica de precipitação seletiva de ácidos nucléicos.

- Em todos os casos de separação e recuperação das enzimas, processos adicionais de purificação podem ser aplicados a fim de preparar um produto com maior grau de pureza. As técnicas empregadas, bem como suas vantagens e limitações serão discutidas mais adiante nesse curso.

Enzimas de origem vegetal

- As enzimas de origem vegetal que têm encontrado maior aplicação industrial são, de fato, misturas de proteases usadas na indústria de alimentos, principalmente no amaciamento de carnes e clarificação de cervejas. Essas proteases são obtidas principalmente do látex oriundo de frutos verde do mamoeiro papaia (Carica papaya) e abacaxi (Ananas comosus).

- As proteases do mamão são comumente chamadas de papaína e as do abacaxi de bromelina

- Essas enzimas são comumente comercializadas como extratos brutos, concentrados ou mesmo secos a vácuo. Várias etapas de purificação dessas enzimas são possíveis e discutidas mais adiante.

- Um grupo variado de outras enzimas de origem vegetal tem sido estudado e suas obtenções e aplicações comerciais ainda não estão amplamente estabelecidas. Há uma série de limitações com relação a manutenção da qualidade de enzimas de origem vegetal, especialmente nos extratos brutos, visto a grande diversidade de tipos de planta e estado de maturação dos frutos ou tecidos que darão origem às enzimas.

- Um excelente compêndio sobre enzimas de origens variadas, bem como suas aplicações, é mostrado em dois anexos do livro "Industrial Enzimology, Godfrey T e West S, 1996, Data index 3 e 4".

- Um grupo adicional de enzimas de origem vegetal corresponde às amilases presentes nos cereais submetidos à produção de malte. De fato essas enzimas são comercializadas de forma diretamente retida no interior dos grãos de cereais que passaram pelo processo de malteação e são quase que exclusivamente usadas na produção de cervejas. Como essas enzimas são comercializadas retidas nos próprios grãos dos cereais, normalmente são excluídas nos cômputos das enzimas de interesse industrial.

Enzimas de origem animal

- Como no caso das enzimas de origem vegetal, boa parte das enzimas de origem animal corresponde a proteases, apesar de algumas lipases e amilases também serem encontradas na mistura denominada de pancreatina (oriunda de tecidos do pâncreas suíno).

- Entre as enzimas de origem animal com aplicação comercial ainda se destacam a pepsina e a renina (proteases).

- A obtenção dessas enzimas passa geralmente pela maceração do tecido onde são produzidas no animal (geralmente órgãos como o estômago ou o pâncreas), seguida da extração com soluções tampão apropriadas. A suspensão preparada é então submetida a um processo de separação sólido-líquido e processada de forma similar ao descrito para as enzimas de origem microbiana.

3.2 – Técnicas de purificação de enzimas

Bibliografia recomendada:

Bioquímica, Lehninger et al., 1976, vol 1, Cap 7 e/ou;

Biotecnologia Industrial, Almeida Lima et al. 2001, vol 3; Cap. 17 e/ou;.

Biochemistry, Voet D e Voet JG, 1995, Cap 5.

- As técnicas de purificação de enzimas, de fato, são comuns às de todas as demais proteínas. No caso específico das enzimas, é fundamental considerar que qualquer técnica de purificação empregada deve, além de permitir recuperar a proteína numa forma mais pura, deve também proporcionar a obtenção da proteína na forma ativa. Em outras palavras, a enzima não pode perder sua atividade.

- Os diferentes procedimentos empregados na purificação das enzimas podem se agrupados com base na característica da proteína que serve como base para a separação:

Característica da Proteína Procedimento de separação

Solubilidade 1. Precipitação por salificação

2. Precipitação isoelétrica

3. Precipitação por solventes

Carga 1. Cromatografia de troca iônica

2. Eletroforese

3. Focalização isoelétrica / Precipitação isoelétrica

Polaridade 1. Cromatografia de adsorção

2. Cromatografia em papel

3. Cromatografia em fase reversa

Tamanho 1. Diálise e ultrafiltração

2. Cromatografia de permeação em gel

3. Eletroforese em gel

4. Ultracentrifugação

Especificidade 1. Cromatografia de afinidade

- Nesse tópico iremos apresentar e discutir alguns desses procedimentos

Procedimentos de purificação baseados na solubilidade

A) Precipitação por salificação ("salting out") – Efeitos da concentração de sais sobre a solubilidade

- A solubilidade de uma enzima em uma solução aquosa depende da força iônica* dessa solução. Um pequeno aumento da força iônica leva a um aumento na solubilidade. No entanto, forças iônicas maiores que 1,2-2, geralmente proporcionam uma diminuição considerável da solubilidade das proteínas. Esse fenômeno é a base dos procedimentos de precipitação por salificação.

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Revisão* A força iônica de uma solução é definida como: I = ½ S Ci x Zi²

onde: Ci = concentração molar de cada íon em solução

Zi = carga da cada íon em solução

Por exemplo: Força iônica de uma solução 1,5 M de (NH₄)₂SO₄:

1 mol de (NH₄)₂SO₄ em solução gera 2 moles de NH₄⁺ e 1 mol de SO₄^2-

Então: I = ½ x (1,5x2x1² + 1,5x1x2²) = 4,5

Como exercício, re-estruture a figura que apresentamos anteriormente (mostrando a solubilidade de proteínas em função da força iônica) usando agora concentração de sulfato de amônio no lugar da força iônica.

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- Obviamente, a solubilidade da enzima é dependente de sua estrutura e o efeito da força iônica sobre a solubilidade varia de uma enzima para outra.

- O aumento da força iônica da solução aquosa pode ser obtido pela adição de sais a essa solução. Vários sais podem ser empregados. Para processos de purificação em escala ampliada, o custo e a pureza do sal empregado passa a ser de grande importância. Um dos sais mais empregados para esse fim é o sulfato de amônio que possui uma solubilidade elevada em água (aproximadamente 3,9 mol/L).

B) Precipitação isoelétrica – Efeitos do pH sobre a solubilidade

- O pH também exerce efeito marcante sobre a solubilidade das enzimas. Geralmente, a solubilidade da enzima é mínima no pH isoelétrico* (ou ponto isoelétrico).

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Revisão* pH isoelétrico é o pH no qual a proteína não apresenta carga efetiva. Lembre que numa proteína, há grupos funcionais dos aminoácidos que podem estar carregados dependendo do pH. Grupos amino podem estar protonados em pH ácido e grupos carboxílicos podem estar desprotonados em pH alcalino. Obviamente esse equilíbrio depende do pKa/pKb de cada grupo envolvido.

- O pI de uma enzima depende, portanto, de sua composição de aminoácidos.

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C) Precipitação por adição de solventes – Efeitos da constante dielétrica da solução sobre a solubilidade

- A uma dada força iônica e pH, a solubilidade das enzimas é proporcional a constante dielétrica da solução. Esse fato permite precipitar proteínas contidas em solução aquosa pela adição de solventes de constante dielétricas menores que a da água. Em geral, etanol e acetona são usados para essa finalidade. A constante dielétrica desses solventes é 24 e 21, respectivamente, enquanto a da água é 80. Usualmente a adição de um igual volume de etanol a uma solução aquosa da enzima (resultando numa solução com 50% de etanol) é suficiente para precipitá-la.

- Um aspecto limitante dessa técnica é que algumas enzimas são desnaturadas pela adição do solvente, especialmente se a temperatura da mistura não é mantida em valores o mais próximo de 0ºC possível.

Em todos os procedimentos descritos anteriormente (A-C) a enzima é separada da solução por precipitação. Uma etapa posterior de purificação é, portanto, a separação do sólido precipitado do líquido remanescente. Essa separação pode ser feita simplesmente por filtração e mais comumente por centrifugação se a quantidade de sólido precipitado é pequena ou se a enzima pode ser perdida por adsorção no meio filtrante.

Todos os procedimentos descritos anteriormente são usualmente realizados a baixas temperaturas para minimizar as possibilidades de desnaturação da enzima e a conseqüente perda de atividade. A faixa ideal de temperatura para essas operações (incluindo a centrifugação e a filtração) é de 0-5ºC.

Procedimentos de purificação baseados na carga

- A carga efetiva de uma proteína depende do pH, como já mencionado anteriormente. Os procedimentos de purificação baseados na carga são, portanto, diretamente dependentes do pH.

- Uma visão mais clara sobre o efeito do pH na carga efetiva de uma proteína pode ser observado pela avaliação de sua curva de titulação. O entendimento dessas curvas de titulação é muito importante para definir o tipo de método a ser empregado na purificação de determinada enzima quando se usa um procedimento baseado na carga.

A) Cromatografia de troca iônica

- A cromatografia de troca iônica é amplamente empregada para a purificação de enzimas. As colunas cromatográficas mais utilizadas empregam fases estacionárias que são derivados de celulose:

DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) a pH 7,0

- A DEAE-celulose funciona como uma resina trocadora de ânions e, portanto, é aplicável na purificação de enzimas com carga efetiva negativa.

CM-celulose (carboximetilcelulose) a pH 7,0

- A CM-celulose funciona como uma resina trocadora de cátions e, portanto, é aplicável na purificação de enzimas com carga efetiva positiva.

- No procedimento cromatográfico, uma mistura de proteínas é aplicada na coluna que em seguida é eluída com uma solução de pH pré-definido.

A definição do pH é feita como segue:

- acima do pI para a proteína de interesse, quando se usa uma coluna trocadora de ânions

- abaixo do pI para a proteína de interesse, quando se usa uma coluna trocadora de cátions

- Nas condições definidas acima, a enzima apresentará forte interação eletrostática com a fase estacionária da coluna. Freqüentemente a coluna é percolada com um gradiente salino (e não de pH) a fim de, paulatinamente, aumentar a interação enzima-solvente e então permitir que a enzima seja eluída da coluna.

- Algumas fases estacionárias utilizadas em cromatografia de troca iônica associam a separação por troca iônica com a separação por tamanho (abordado mais a frente). Nesses casos a eficiência de separação é ainda maior, pois, por exemplo, proteínas com características eletrostáticas semelhantes, porém com tamanhos diferentes podem ser separadas eficientemente.

B) Eletroforese e eletrofocalização

- Essas duas técnicas se baseiam na mobilidade de uma proteína quando submetida a um campo elétrico. As técnicas eletroforéticas são muito empregadas na caracterização analítica de proteínas, mas raramente são usadas na purificação preparativa.

Procedimentos de purificação baseados no tamanho

A) Diálise e ultrafiltração

- A diálise é uma das técnicas mais simples de purificação baseada no tamanho. Basicamente se utiliza uma membrana semipermeável para reter moléculas protéicas permitindo a passagem das moléculas menores do soluto e da água.

- Há membranas de cortes para massas molares variadas que vão desde 1000 Da até 30 kDa ou mais.

- A diálise é usada freqüentemente após uma etapa de precipitação com sulfato de amônio. Normalmente o precipitado carrega quantidade significativa de sal (além da enzima) e requer a dessalinização por diálise.

- A ultrafiltração está baseada num princípio semelhante ao da diálise, ou seja, moléculas menores são separadas da solução contendo a enzima de interesse, através da passagem por uma membrana semipermeável. Muitas vezes a ultrafiltração é empregada e classificada como uma etapa de concentração, uma vez que permite a retirada de grande quantidade de água além de solutos de baixa massa molar.

- A força que impulsiona a solução de enzima sobre a membrana semipermeável pode ser: pressão exercida por um gás (tipicamente nitrogênio); força centrífuga ou ainda a filtração contra vácuo. Existem equipamentos específicos destinados a ultrafiltração preparativa que operam por filtração contra vácuo e que associam ainda o uso da circulação da solução contendo as enzimas sobre a membrana para minimizar a obstrução da membrana.

B) Cromatografia de permeação em gel

- Essa técnica pode ser aplicada tanto com caráter preparativo como analítico (na determinação de massa molar de enzimas). O princípio da técnica está baseado na exclusão seletiva (por tamanho) de moléculas por um gel (Sephadex, Agarose e outros) de porosidade conhecida.

- A técnica comumente é usada através da permeação da mistura de enzimas em uma coluna empacotada com o gel. Pode-se ainda usar o gel como agente de concentração de soluções de proteínas, uma vez que seus poros podem reter água e moléculas de baixa massa molar. Para isso se adiciona a solução com enzimas sobre uma certa quantidade de gel seco.

- Uma coluna cromatográfica empacotada com um gel de exclusão pode ainda ser calibrada com proteínas de massa molar conhecidas e então usada como ferramenta analítica para a determinação de massas molares de proteínas desconhecidas.

Procedimentos de purificação baseados na especificidade

Cromatografia de afinidade

- Essa técnica está baseada num procedimento de eluição da enzima em uma coluna que tem ligado (covalentemente) à fase estacionária um "pseudo-substrato", ou usualmente um co-fator da enzima. A enzima fica então "aderida" a esse substrato e pode posteriormente ser eluída por um gradiente de força inônica ou por uma alteração de pH.

3.3 Controle de etapas e estratégia experimental na purificação de enzimas

- Os procedimentos de purificação de enzimas devem ser monitorados pela determinação da atividade enzimática (detalhes sobre a determinação da atividade serão discutidos mais adiante nesse curso) após cada etapa. Um diagrama típico com os resultados de um procedimento de purificação com etapas sucessivas é mostrado abaixo:

Etapa	Volume da fração (mL)	Proteína total (mg)	Atividade enzimática total (IU)	Atividade específica (IU/mg de proteína)	Razão de purificação (ativ. espec. após purif./ ativ. espec. antes purif.)
Extrato celular bruto	1.400	10.000	100.000	10	1
Precipitação	280	3.000	96.000	32	3,2
Cromatografia de troca iônica	90	400	80.000	200	20
Cromatografia de permeação em gel	80	100	60.000	600	60
Cromatografia de afinidade	6	3	45.000	15.000	1500

- No quadro apresentado anteriormente, há uma seqüência de procedimentos preparativos de purificação que envolveu as seguintes etapas:

Precipitação > Cromatografia de troca iônica > Cromatografia de permeação em gel > Cromatografia de afinidade

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Exemplo de purificação e recuperação:

Suponha uma mistura de proteínas que contém uma enzima de interesse (volume inicial de 2L com 1000 mg de proteína total e 10.000 UI da enzima). A enzima de interesse apresenta ponto isoelétrico igual a 8 e massa molar igual a 50 kDa. As demais enzimas apresentam pontos isoelétricos menores que 8 e massas molares variando entre 10 e 60 kDa (veja aqui uma eletroforese bidimensional com informações sobre a mistura)

Estratégia adequada de purificação:

Etapa	Volume da fração (mL)	Proteína total (mg)	Atividade enzimática total (IU)	Atividade específica (IU/mg de proteína)	Razão de purificação (ativ. espec. após purif./ ativ. espec. antes purif.)
Extrato bruto	2.000	1.000	10.000	10	1
Ultrafiltração com corte de 20 kDa	200	500	9.500	19	1,9
Cromatografia de troca iônica em CMC a pH 6,5 e eluição com gradiente de NaCl	20	200	9.200	46	4,6

Pense: O que aconteceria se você, após a ultrafiltração, partisse para uma purificação por exclusão molecular com um gel de fracionamento entre 20 e 100 kDa?

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- A definição da seqüência de etapas a ser utilizada é considerada como a estratégia experimental de purificação. É obvio que muitas combinações podem ser utilizadas e a decisão de utilizar uma seqüência ou outra depende de vários fatores. Quanto maior for o conhecimento sobre as características da enzima alvo, maiores as chances de definir uma estratégia eficiente de purificação. Experimentalmente é comum se realizar uma seqüência inicialmente empírica a fim de obter alguns parâmetros sobre a enzima desconhecida, como massa molar e características ácido-base (determinação do ponto isoelétrico se possível).

- Em escala de laboratório, usualmente o custo de cada etapa de purificação não é determinante na escolha. Já em escala industrial, a purificação é realizada com uma variável adicional que é o custo/benefício do procedimento. Ou seja, muitas vezes se opta por um procedimento de menor custo, mesmo que em detrimento de alguma eficiência.

Há um software disponível na internet que permite ao usuário avaliar suas estratégias para purificar proteínas.

Esse software foi criado e gentilmente disponibilizado pelo Prof. Andrews G. Booth (Protein Lab", by A.G. Booth, School of Biochemistry and Biotechnology, University of Leeds, Leeds, United Kingdom)

Você pode realizar o download e instalar em seu computador. O arquivo é pequeno e de fácil instalação e uso.

Procedimentos

1) Crie uma pasta específica no seu microcomputador

2) Faça o download dos 5 arquivos abaixo para a pasta recém criada

3) Através do explorador do windows execute o aplicativo protlab.exe

download 1

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Página principal referente ao software: www.bio-link.org/clearinghouse/protein.htm

Pratique com o software. É interessante e lhe permitirá realizar muitos experimentos sem sair da sua sala.

Exercícios de fixação 1

4. Conceito de unidade enzimática e atividade específica

Bibliografia recomendada:

Bioquímica, Lehninger et al., 1976, vol 1, Cap 8 e/ou;

Enzymes: a practical introduction to structure, mechanism and data analysis, Copeland, R.A., 2000, Cap. 5

- A quantificação da atividade enzimática está intimamente ligada ao estudo da cinética das reações catalisadas por enzimas.

- Até o momento discutimos sobre a origem e as formas de obter enzimas de uma forma relativamente purificada. Uma demanda imediata em todos os procedimentos experimentais relacionados a esse tema é a determinação da atividade enzimática. É necessário ter claro que determinar quanto há de uma determinada enzima em uma solução é uma questão muito mais complexa que determinar, por exemplo, quanto há de um determinado composto químico de baixa massa molar. Como temos visto, uma enzima de interesse é produzida simultaneamente com outras enzimas, além de uma infinidade de metabólitos não enzimáticos. Ou seja, determinar, por exemplo, quanto há de proteína em uma solução não representa, de forma alguma, quanto há da enzima de interesse.

- Felizmente, as enzimas, em geral, proporcionam reações únicas e essa característica pode ser usada para quantificá-las. Se uma enzima catalisa uma dada reação, como ilustrado abaixo, pode-se assumir que a quantidade de produto formado ou de substrato consumido será proporcional a quantidade de enzima presente na solução.

E + S D ES D E + P, onde:

E = enzima; S = substrato; P = produto

- Como sabemos, a partir de estudos prévios sobre a cinética enzimática, a velocidade de conversão de um substrato depende da concentração do substrato presente na reação.

- Para um excesso de S no meio reacional, a velocidade dessa reação é determinada pela segunda etapa, ou seja, pelo desproporcionamento do complexo ES, gerando a enzima livre (E) e o produto da reação (P). Nessas condições, quantificar P é uma forma eficiente e indireta de determinar quanto há de E em uma dada solução (veja discussão detalhada sobre essa questão no item 5).

- Com base nesse princípio, apresentado de forma simplificada, pode-se entender a definição de atividade enzimática expressa com base na formação de um dado produto de reação:

A definição amplamente usada na literatura relaciona:

1 UI (unidade internacional de enzima), corresponde à formação de 1 micromol de P por minuto de reação

(pode-se ainda definir a mesma unidade como: consumo de 1 micromol de substrato por minuto)

- Essa definição é que permite todos os estudos comparativos da enzimologia. Ou seja, se queremos comparar, por exemplo, dois sistemas de fermentação distintos, que produzem a mesma enzima extracelular, podemos simplesmente proceder à reação mencionada anteriormente com um volume definido do meio fermentado que contém a enzima. Feita a reação, medimos quanto de P foi formado em um intervalo de tempo. Com isso em mãos, podemos expressar quanto há de enzima em cada caso em UI/mL de meio fermentado. Obviamente o processo que gerar um maior número de UI/mL é o que contém a maior quantidade da enzima de interesse.

- Uma outra unidade para a atividade enzimática tem sido recomendada pela "Enzyme Comission" que normaliza a nomenclatura e as definições no campo da enzimologia. Essa unidade é o katal (abreviado como kat). Nessa unidade, se expressa a conversão de um substrato em mol.s^-1. Usualmente as conversões são da ordem de nanomoles por segundo o que acarreta no uso freqüente da unidade como nkat (nanomoles covertidos por segundo).

- Verifique quantos nkat equivalem a 1 UI.

- A atividade enzimática é freqüentemente expressa com base em UI por alguma medida de volume ou massa. Dessa forma é comum expressar a atividade em:

UI/volume de meio fermentado ou volume de um extrato enzimático

UI/massa de um substrato (muito freqüente em fermentações em meio sólido)

- A expressão da atividade enzimática em UI/massa de proteína total existente na solução é denominada de atividade específica. Essa medida é muito usada nos procedimentos de purificação de enzimas, pois à medida que a solução vai sendo enriquecida na enzima de interesse a atividade específica vai aumentando.

5. Métodos de determinação da atividade enzimática

- Para determinar a atividade enzimática experimentalmente é necessário determinar a conversão de um substrato em função do tempo de reação, já que a atividade é expressa em UI ou kat e que ambas unidades refletem a conversão do substrato em função do tempo.

- Uma reação qualquer catalisada por uma enzima fornece dados que indicam que o consumo de substrato ou a formação do produto de reação seguem uma tendência exponencial com o tempo de reação.

- A interpretação desse dado mostra que, tanto o desaparecimento do substrato como a formação do produto, estão "espelhados" e que uma função exponencial poderia explicar a reação em função do tempo:

[S] = [S_o] e^-kt

onde: [S] = concentração do substrato num dado tempo

[So] = concentração incial do substrato

k = constante de velocidade para uma reação de pseudo-primeira ordem

t = tempo de reação

- A velocidade dessa reação seria portanto:

v = - d[S]/dt = d[P]/dt = k[S_o] e^-kt

- Aqui nos deparamos com duas questões que são muito importantes na determinação experimental da atividade enzimática:

1) Observa-se que à medida que passa o tempo, a velocidade da reação diminui e isso seria esperado, pois a concentração de substrato vai diminuindo e, também, na grande maioria dos casos, porque o produto de reação inibe a própria catálise enzimática (ou até mesmo desnatura a enzima dependendo do caso). Lembre aqui do equilíbrio químico que está envolvido nessa reação. Isso implica que para descrevermos a atividade enzimática, devemos sempre determinar a maior velocidade da reação catalisada pela enzima, ou seja a tangente da curva d[S]/dt (ou d[P]/dt) em função do tempo de reação que passa pelo t =0.

2) Como se observa na equação diferencial mostrada anteriormente, a velocidade de reação deve depender da concentração do substrato e essa dependência deveria ainda ser linear. No entanto, vimos anteriormente que a velocidade de reação não é linearmente proporcional a concentração do substrato. Essa aparente contradição, foi tema de grande questionamento no passado e de forma simplificada e qualitativa podemos entender o fenômeno como segue:

k1 k2

E + S D ES D E + P, onde:

E = enzima; S = substrato; P = produto

- Se a reação, para uma dada quantidade de enzima ocorre na presença de uma baixa concentração de substrato, à medida que essa concentração vai aumentando se espera que a velocidade da reação aumente proporcionalmente. Ou seja, a constante de velocidade k1 é que determina a velocidade de reação. No entanto, se há um excesso de substrato na reação, pode-se assumir que toda a enzima disponível está na forma do complexo ES e então a constante de velocidade k2 é que determina a velocidade da reação. Nessas condições é que se determina a velocidade máxima de reação catalisada por uma enzima.

Portanto, as duas questões apresentadas anteriormente, são resolvidas em termos experimentais realizando as determinações de atividade em elevadas concentrações de substrato e determinando a tangente da curva de conversão em função do tempo. A determinação dessa tangente pode ser graficamente difícil e, usualmente, busca-se condições experimentais que permitam obter ao menos 3 ou 4 pontos na curva [S] ou [P] versus t ainda dentro de uma reta, cuja inclinação fornece a velocidade inicial máxima da reação.

Aspectos práticos da determinação de atividades enzimáticas (acesse aqui um compêndio sobre o tema)

(acesse aqui um exemplo de determinação de atividade a partir de dados experimentais)

6. Aplicação de enzimas

Bibliografia recomendada:

Industrial Enzimology, Godfrey T. e West S (eds), 1996

- Nesse tópico discutiremos alguns exemplos de enzimas que encontram aplicação industrial. São exemplos tomados da literatura e o objetivo aqui é simplesmente apresentar alguns segmentos industriais que já fazem uso de enzimas em grande escala. Para isso discutiremos alguns capítulos do livro Industrial Enzymology (Godfrey & West, 1996).

a) Aplicação de enzimas na indústria dos detergentes (cap. 2.10)

b) Aplicação de enzimas no processamento de amido (Cap 2.20)

c) Aplicação de enzimas na indústria têxtil (cap 2.21)

d) Aplicação de enzimas na biotransformação de produtos químicos (cap2.8)

e) Enzimas usadas na conversão de materiais lignocelulósicos

7. Aulas práticas (05 grupos de experimentos e 05 relatórios) Note que para os experimentos 3 e 3.1 se requer somente 1 relatório.

1) Projeto de purificação de enzimas via software. Cada grupo receberá uma mistura problema e deverá apresentar 2 seqüências lógicas de purificação com os respectivos resultados e sua discussão (01 aula – 04 horas)

2) Calibração de uma coluna cromatográfica e determinação da massa molar de proteína desconhecida (02 aulas - 06 horas)

3) Produção de invertase por Saccharomyces cereviseae, recuperação da enzima a partir do meio fermentado e determinação de sua atividade (01 aula – 4 horas)

3.1) Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade de invertases produzidas por Saccharomyces cereviseae (02 aulas – 06 horas)

4) Extração e uso de amilases do malte no processamento do amido (01 aula - 4 horas)

5) Projeto de extração e determinação de enzimas envolvidas na conversão de biomassa lenhosa produzidas por fermentação em meio sólido (03 aulas – 10 horas)